تحليل الاسبارتيت امينوترانسفيريز (AST) او الGOT|كاينتك IFCC|spinreact kit

تحليل انزيم الAST في الدم

من دلائل وظائف الكبد

Kinetic Technique (IFCC Method)

الفكرة العامة

I) Introduction

1) Names:-

Formal name: Aspartate Aminotransferase (AST)

Also known as: Serum Glutamic-Oxaloacetic Transaminase; SGOT; GOT; Aspartate Transaminase.

2) What is the ALT?

اقراها في تحليل انزيم الAST التعريف وتثقيف المريض . اضغط هنا

3) Why it is required?

اقراها في تحليل انزيم الAST التعريف وتثقيف المريض . اضغط هنا

4) When should you get tested?

اقراها في تحليل انزيم الAST التعريف وتثقيف المريض . اضغط هنا

5) What are the needed preparations before the test?

اقراها في تحليل انزيم الAST التعريف وتثقيف المريض . اضغط هنا

II) Required sample:-

1) Sample type:-

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

2) Sample collection method:-

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Criteria for sample rejection:-

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

III) The Test:-

Kinetic technique (IFCC METHOD)

By SPINREACT kits

1) Principle

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

2) Devices used:-

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Reagents:-

Note that there are many types of the kits of AST in spinreact company. We choose the one of the references 41270&41272&41273.

  • Composition:-
    • Reagent 1 (R1) (Substrate and BUFFER 7.8): Tris 80 mmol/L, Lactate dehydrogenase (LDH) 800 mmol/L, Malate dehydrogenase (MDH) 600 U/L, L-Aspartate 200 mmol/l, pH 7.8.
    • Reagent 2 (R2) (Substrate): NADH 0.18 mmol/L, ɑ-ketoglutarate 12 mmol/L.
  • STORAGE
    • Store at 2-8ºC.
    • Reagents are stable until the expiry date shown on the label when stored tightly closed, protected from light and contaminations prevented during their use.
  • Indications of deterioration:
    • The presence of particulate material, turbidity and the absorbance of the blank lower than 1.0 at 340 nm (1 cm cuvette).
  • Reagent preparation
    • Working Reagent: Mix 4 vols or R1 + 1 Vol of R2. Mix gently. (because the cuvette is filled by 1 ml, you will mix 800µl R1 with 200µl R2 [4R1:1R2])
      • Stable for 21 days at 2-8ºC or 72 hours at room temperature (15-20oC).

هنا بقى هنتكلم عن الطريقة الكاينتك بس باستخدام spinreact .. طبعا فكرة العمل والأجهزة واحدة لكن الكيتس هتختلف … في شركة spinreact فيه أنواع مختلفة من كيتس الAST احنا اخترنا اللى الID بتاعهم في الشركة 41270 و 41272و41273.. تركيبه بيتكون من حاجتين R1 وده فيه واحد من المتفاعلات وهو ال اسبارتيت L-aspartate وكمان الbuffer عشان يظبط الpH  ومعاهم الLDH وكمان الMDH المطلوب في المعادلة التانية وR2 وده بيتكون من الفا كيتوجلوتاريت ɑ- ketoglutarate  اللى هيتفاعل مع الL-aspartate زمعاه الNADH اللى هيتاكسد بتفاعله مع اوكسالواسيتيت oxaloacetate عشان نقدر نشاط الAST

الكيتس بيتخزن عند درجة حرارة من 2 ل8 يعنى في التلاجة والكيتس بتبقى ثابتة لحد تاريخ انتهاء الصلاحية طالما مقفولة كويس ومتخزنة طبعا عند درجة حرار من 2 ل8 وطبعا لو حفظتها برضو من التلوث وتعرف ان الكيتس بقى مينفعش تشتغل بيه لما تلاقي تعكير او درجة الامتصاص بتاعه عند 340 اقل من 1.0

بنحضر الكيتس كالاتي:- بتحط  بنسبة 4R1:1R2 يعنى مثلا 4 مللي من R1 على 1 مللي من R2 .. والخليط ده بيفضل صالح لمدة 21 يوم في التلاجة عند درجة حرارة 2 ل 8 او 72 ساعة لو عند درجة حرارة الغرفة يعنى من 15 ل20 يعنى في الشتا ولو حد نسيه برة التلاجة في الصيف يبقى باظ .


4) Procedure:-

Note:- these procedures are for spectrophotometer users, not for semi-automated users

  1. Prepare the work solution as mentioned in the reagent.
  2. Bring the working solution and the temperature to the reaction temperature.
  3. Clean the cuvettes, if you use a spectrophotometer or semi-automated analyzer without suction system, or flush the aspiration system of your semi-automated analyzer, if it has a suction system, by keeping the tubing in a distilled water for 2 minutes.
  4. Zero the spectrophotometer or photometer with distilled water or air at 340nm.
  5. Pipette 1.0ml of the prepared working reagent into appropriate tubes or cuvettes and incubate at 250C or 37°C or 30oC  (fixed temperatures) for one minute in the water bath or in the spectrophotometer if it has a built-in incubator. (this incubation to bring the reagent to 37oC).
  6. Transfer 0.10ml (100µl) of the sample to the incubated 1.0 ml working solution.
  7. Start the stopwatch immediately after sample addition and wait for a one-minute delay. This delay is to get the first absorbance from which the first-minute reading will be subtracted (see the calculation section for more information) (NOTE: – the volume of the sample and the incubation time is recommended by the reagent supplier).
  8. Read the absorbance of the one-minute delay, then read the absorbance every one minute for 3 minutes intervals (3 readings total). And you should return the solution to the incubation after each reading to keep the temperature of the solution at 37oC.
  9. Calculate mean absorbance difference/minute (ΔA/Min.). Then multiply it by the factor that we will calculate in the next section.
  10. If the sample is hemolyzed, collect another sample and of it is icteric or lipemic, dilute the sample 1 in 10 with distilled water (how to make dilution and calculate the dilution factor click here).

In the case, if you use a semi-automated analyzer, you will flush the suction system, if it has a suction system, or clean the cuvettes, if it has not a suction system. Then choose the programmed procedure for AST test or ALT test (you program it according to the reagent supplier) (either program are allowed because they have the same parameters) … In this case, you can prepare the working solution in a cuvette, if it has not a suction system, or a tube, if it has a suction system. Then place the cuvettes or tubes in the thermostable cell holder of the semi-automated analyzer or in the water bath to reach the reaction temperature, then read the blank and then add the sample, then the analyzer starts its own timer and takes the readings as scheduled then multiply the absorbance by the factor which we will calculate in the calculation section. (if you don’t make the analyzer start reading after adding the sample immediately, you will get false low result) DON’T forget to flush again at the end of the test if it has a suction system. IT IS EASIER THAN SPECTROPHOTOMETER

الخطوات:- بنحضر الكيتس ذي ما قولنا وننضف الكيوفت والانابيب او نخلي الجهاز النصف اوتوماتك يشطف الأماكن اللى هتنزل فيها الreagent  والعينة وبنصفر الجهاز بماية مقطرة او على الهوا عند 340 وبنسحب بالماصة 1 مللي من الكيتس اللى حضرناها وبنحطها في انابيب وبنحضن لمدة دقيقة عند درجة حرارة25 او 37 او عند 30 وطبعا فترة التحضين عشان الكيتس ياخد درجة حرارة25 او 37 او 30 على حسب درجة الحرارة اللى بتشتغل عليها … بعد كدة هناخد 100 ميكرو من العينة وتحطهم على ال1مللي من الكيتس اللى سايبه يتحضن وبتعمل ميكس كويس وبتحضن الخليط لمدة دقيقة عند درجة الحرارة اللى بدات عليها … بعد كدة بتقيس الabsorbance بعد الدقيقة دي وبترجع المحلول للحمام المائي وبعد كدة تعدي دقيقة كمان وتاخد قراءة تاني وترجع الخليط للتحضين وبعد دقيقة كمان تاخد قراءة تالتة وكمان قراءة رابعة بعد دقيقة كمان … ممكن تسال ليه 4 قراءات او بمعنى اصح ليه بنستنى دقيقة تحضين اذا كان المحلول أساسا عند 37 درجة؟ عشان احنا الفروض بنحسب الΔA يعنى الفرق في الabsorbance وعشان نحسب ده لأول دقيقة لازم نطرح القراءة من القراءة اللى قبلها فالبتالي اول قراءة خالص عشان نطرح منها تاني قراءة وهكذا لحد ما تلاقي 3ΔA … وبعد كدة بتقيس متوسط الامتصاص لل3ΔA خلال الدقيقة الواحدة يعنى هنجمعهم ونقسم على 3 ونضرب النتيجة في الفاكتور اللى هنحسبه في العنوان بتاع الحسابات وهنا بيقولك ولو كانت العينة هيموليزد او يعنى فيها هيموجلوبين نتيجة تكسير كرات الدم الحمرا اثناء سحب العينة هتغير العينة وهتجيب عينة تانية ولو كانت فيها دهون يعنى السيرم  مشبر او العينة فيها بليروبين كتير يبقى هتخفف السيرم او البلازما بماية مقطرة تخفيف 1 ل10 يعنى مثلا 50 ميكرو سيرم تحط عليها 450 ميكرو ماية مقطرة. اضغط هنا عشان تعرف اذاي بنعمل تخفيف واذا تحسب معامل التخفيف.

وطبعا لو انت بتستخدم جهاز نصف اوتوماتك، بعد ما تشطف نظام الشفط او هتنضف الكيوفتات هتختار البرنامج بتاع تحليل ALT او الAST (الاتنين بيتبرمجوا بنفس الخواص) اللى انت برمجته أساسا بناءا على الكيتس اللى بتشتغل بيها لما جبت الجهاز جديد او لما غيرت الكيتس … بعد كدة لو الجهاز بتاعك سيمي اوتوميتيد ومن غير نظام شفط او suction يعنى يبقى هتحط الreagent في الكيوفيت علطول ولو ليه نظام شفط هتحطه في انابيب وسواء كيوفيت او انابيب هتحطها في مكان التحضين في الجهاز او في الحمام المائي ولما تسيبها في التحضين فترة بتحط العينة بتاعتك سواء سيرم او بلازما وبعد كدة بتبدا قراءة علطول … طبعا البرنامج بتاع الجهاز بيعد مع نفسه ال3 دقايق وفي كل دقيقة بياخد قراءة وبيحسب وبيضرب في الفاكتور اللى بتشوفه في البانفلت بتاعة الكيتس واللى هنشوف فالعنوان بتاع الcalculation اذاي بيتحسب … لو اتاخرت شوية فانك تخلي الجهاز يبدا قراءة التحليل ويحسب الوقت هتكون النتيجة غلط لانها هتكون اقل من المفروض تكون عليه ومتنساش تشطف نظام الشفط تاني بعد نهاية التحليل … طبعا ده اسهل بكتير.

 

5) Calculation:-

First, we allow a delay for 1 min and take the first absorbance reading. Then, we read the absorbance every 1 minutes for 3 minutes. Thus, we take 4 absorbance readings (one after the delay period [Adelay] and 3 for the next 3 minutes; A1, A2 and A3 respectively). Then, the ΔA/min is measured as follow: –

ΔA1/min (For the first minute) = A1 – Adelay

ΔA2/min (For the first minute) = A2 – A1

ΔA3/min (For the first minute) = A3 – A2

The result of these will be negative values, however, we will neglect the negative sign because it is not important in clinical diagnosis and it doesn’t make sense to see activity with negative sign.

Then take the average of the 3 ΔA: –

average of the 3 delta a

The AST activity is calculated in the sample from the next equation: –

ast calculation

Read more about the calculation of AST in the basics of Kinetic techniques. click here to know how we get this equation and how to find out the measuring units.

(ε) is the molar absorptivity of NADH at 340nm; equals 6300 (i.e. measuring the amount of light absorbed per mole when the light pass through a path length of 1 cm)

(l) is the cuvette path length; 1 cm

(Vt) the total volume of the reaction; 1.1ml (1.0 reagent +0.10 sample)

(Vs) the sample volume; 0.1 at 30oC or 0.5ml at 37oC

(106) : 1000 to convert U/ml to U/L and 1000 for conversion from Millimolar absorptivity of NADH  to molar absorptivity; the unit of the molar absorptivity.

Spinreact calculates the factor:

ast spinreact factor

But in spinreact kit, the factor is 1750, not 1746

Then it gives factors to convert from temp to another;

  • To correct results to other temperatures multiply by:
 Assay temperatureConversion factor to 
25ºC25ºC25ºC
 25ºC
25ºC
25ºC
1.00
0.73
0.48 
1.37
1.00
0.65
2.08
1.54
1.00 

How to use this table? If you perform the test at 250C and want to convert the value of the result to the value at 30OC, then you should multiply the result by 1.37

If the sample is lipemic and you dilute the sample 1 in 10, for example, at 30oC, you will add 0.9ml (900µl) distilled water to 0.1ml (100 µl) sample (1:10) then the sample volume after dilution will be 1ml and during the test you will take 0.1 ml of this diluted sample. The calculate the dilution factor from the following equation:-

If you want to know how to calculate the dilution factor. Click here.

You can multiply this dilution factor calculated by the factor of the kits if you dilute the sample before the test.



نيجي للحسابات عشان نبقى فاهمينها …. احنا اخدنا 4 قراءات للabsorbance .. هتقولي اذاي اذا كنا بناخد 3 قراءات بس بعد الدقيقة الincubation؟ هقولك يا سيدي … الدقيقة الاولى مشمجرد دقيقة Incubation لكن الabsorbance اللى بعدها مهم في الحسابات … تابع معايا وانت تعرف …يبقى كدة عندنا 4 قراءات الاولى بتاعة الincubation واللى ممكن تسميها delay و3 اللى بعد كل دقيقة …. في كل مرة طبعا الabsorbance بتاع العينة مطروح منه ال absorbance بتاع البلانك وبعد كدة ال4 قيم اللى عندى هنطرح كل واحدة من اللى قبلها فهيبقى عندنا 3 ΔA/min وهنجيب متوسط ال3 قراءات يعنى هنجمع ال3 قيم ونقسم على 3 وبعد كدة هنجيب قيمة الactivity بتاعة الAST من المعادلة … احنا عايزين ΔA/min 3 لو ماخدنا الabsorbance بتاع الدقيقة الاولى هيكون عندنا 2 فقط.

طبعا كلنا عارفين الرموز الموجودة في المعادلة … ال (ε)اسمها الmolar absorptivity  ومن اسمها دى بتعبر عن كمية الضوء الممتص بواسطة المول الواحد من المادة عندما يكون مسار الضوء في الكيوفيت 1سم دى هي اللى ممكن نوضحا بالعربي ولكل مادة ليها molar absorptivity ثابتة عن طول موجي معين وبالنسبة للNADH هنا 6300 عند 340 نانو.

لما نحسب القيم المعلومة عشان نطلع الفاكتور اللى هنضرب فيه بيكون 1746 ولكن في الكيتس بتاع spinreact الفاكتور فيه 1750 وبعد كدة الكيتس ده مقدم جدول فيه فاكتور تاني للتحويل من درجة حرارة للتانية … في الجدول ده لو انت مثلا شغال التحليل عند درجة حرارة 25 وعايز تطلع النتيجة كانك شغالها عند 30 يبقى هتضرب في 1.37 وبرضو نفس الكلام لو العينة فيها دهون كتير يبقى هتخفف العينة 1ل10 يعنى هتاخد 900 ميكرو ماية مقطرة على 100 ميكرو من السيرم وبعد كدة هتحسب التخفيف بNxV=NxV هتلاقيها برضو انك هتضرب في 10… لو عايز تعرف بنخفف وبنحسب معامل التخفيف اذاي اضغط هنا

6) Reference range:-

25ºC30ºC37ºC
Men (Up to)19 U/L26 U/L38 U/L
Women (Up to)16 U/L22 U/L31 U/L

Normal newborns have been reported to show a reference range of up to double the adult, attributed to the neonate’s hepatocytes. These values decline to adult levels by approximately 3 months of age.

These values are for orientation purpose; each laboratory should establish its own reference range.

هنا مدينا القيم الطبيعية عند كل درجة حرارة وبيقول ان في حديثي الولادة بتكون القيم الطبيعية ضعف البالغين وبترجع القيم طبيعية تاني بعد 3 اشهر

IV) Sources of errors:-

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

V) Quality Control:-

اقراها في تحليل الAST الفكرة العامة . اضغط هنا

VI) Interpretation of test results:-

اقراها في تحليل الAST تعريف للمريض وتثقيفه . اضغط هنا

References:-

clevelandcliniclabs.com

labtestonline.com

spinreact.com

boisystems.es

Sankara Nethralaya’s Manual of Medical Laboratory Techniques

Wallach’s Interpretation of Diagnostic Tests Pathways to Arriving at a Clinical Diagnosis

Comments

Facebook Comments