تحليل الالانين امينوترانسفيريز (ALT) او الGPT|كاينتك IFCC|spinreact kit

تحليل انزيم الALT في الدم

من دلائل وظائف الكلية

Kinetic Technique (IFCC Method)

By SPINREACT kits

I) Introduction

1) Names:-

Formal name: Alanine Aminotransferase and abbreviated as (ALT)

Also known as: Serum Glutamic-Pyruvic Transaminase; SGPT; GPT; Alanine Transaminase.

2) What is the ALT?

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Why it is required?

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

4) When should you get tested?

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

5) What are the needed preparations before the test?

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

II) Required sample:-

1) Sample type:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

2) Sample collection method:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Criteria for sample rejection:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

III) The Test:-

Kinetic technique (IFCC METHOD)

By SPINREACT kits

1) Principle

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

2) Devices used:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Reagents:-

Note that there are many types of the kits of ALT in spinreact company. We choose the one of the references 41280&4128.

  • Composition:-
    • Reagent 1 (R1) (Substrate and BUFFER 7.8): Tris 100 mmol/L, L-alanine 500 mmol/L, lactate dehydrogenase 1200 U/L, pH 7.8.
    • Reagent 2 (R2) (Substrate): NADH 0.18 mmol/L, 2-ketoglutarate 15 mmol/L.
  • STORAGE
    • Store at 2-8ºC.
    • Reagents are stable until the expiry date shown on the label when stored tightly closed, protected from light and contaminations prevented during their use.
  • Indications of deterioration:
    • Presence of particulate material, turbidity, absorbance of the blank lower than 1.0 at 340 nm (1 cm cuvette).
  • Reagent preparation
    • Working Reagent: Mix 4 vol or R1 + 1 Vol of R2. Mix gently. (because the cuvette is filled by 1 ml, you will mix 800µl R1 with 200µl R2 [4R1:1R2])
      • Stable for 21 days at 2-8ºC or 72 hours at room temperature (15-20oC).

هنا بقى هنتكلم عن الطريقة الكاينتك بس باستخدام spinreact .. طبعا فكرة العمل والأجهزة واحدة لكن الكيتس هتختلف … في شركة spinreact فيه أنواع مختلفة من كيتس الALT احنا اخترنا اللى الID بتاعهم في الشركة 41280 و 4128.. تركيبه بيتكون من حاجتين R1 وده فيه واحد من المتفاعلات وهو ال الانين وكمان الbuffer عشان يظبط الpH  ومعاهم الLDH المطلوب في المعادلة التانية وR2 وده بيتكون من الاوكسوجلوتاريت اللى هو المتفاعل التاني مع الNADH اللى هيتاكسد بتفاعله مع البيروفيت عشان نقدر نشاط الALT

الكيتس بيتخزن عند درجة حرارة من 2 ل8 يعنى في التلاجة والكيتس بتبقى ثابتة لحد تاريخ انتهاء الصلاحية طالما مقفولة كويس ومتخزنة طبعا عند درجة حرار من 2 ل8 وطبعا لو حفظتها برضو من التلوث وتعرف ان الكيتس بقى مينفعش تشتغل بيه لما تلاقي تعكير او درجة الامتصاص بتاعه عند 340 اقل من 1.0

بنحضر الكيتس كالاتي:- بتحط  بنسبة 4R1:1R2 يعنى مثلا 4 مللي من R1 على 1 مللي من R2 .. والخليط ده بيفضل صالح لمدة 21 يوم في التلاجة عند درجة حرارة 2 ل 8 او 72 ساعة لو عند درجة حرارة الغرفة يعنى من 15 ل20 يعنى في الشتا ولو حد نسيه برة التلاجة في الصيف يبقى باظ .


4) Procedure:-

Note:- these procedures are for spectrophotometer users, not for semi-automated users

  1. Prepare the work solution as mentioned in the reagent.
  2. Clean the cuvettes if you use a spectrophotometer or semi-automated analyzer without suction system or flush the aspiration system of your semi-automated analyzer if it is with suction system by keeping the tubing in a distilled water for 2 minutes.
  3. Zero spectrophotometer or photometer with distilled water or air at 340nm.
  4. Pipette 1.0ml of the prepared working reagent into appropriate tubes or cuvettes and incubate at 250C or 37°C or 30oC  (fixed temperatures) for one minutes in the water bath or in the spectrophotometer if it has built-in incubator. (this incubation to bring the reagent to 37oC).
  5. Transfer 0.10ml (100µl) of the sample to the incubated 1.0 ml working solution.
  6. Start the stopwatch immediately after sample addition and wait for one mintue delay. This delay to make the reaction happen and all the pyruvate is produced (NOTE:- the volume of the sample and the incubation time is recommended by the reagent supplier).
  7. After the one-minute delay, read and record absorbance after 1 minute at 340nm.
  8. Repeat readings every minute for the next two minutes.
  9. Calculate mean absorbance difference/minute (ΔA/Min.).
  10. If the sample is hemolyzed, collect another sample and of it is icteric or lipemic, dilute the sample 1 in 10 with distilled water (how to make dilution and calculate the dilution factor click here).

In the case, if you use a semi-automated analyzer, you will flush the suction system if it has a suction system or clean the cuvettes if it has not a suction system. Then choose the programmed procedure for ALT test (you program it according to the reagent supplier). In this case, you can prepare the working solution in a cuvette if it has not a suction system or tube if it has a suction system. Then place the cuvettes or tubes in the thermostable cell holder of the semi-automated analyzer or in the water bath, then read the blank and then add the sample, start reading immediately after adding the sample, where the analyzer starts its own timer and takes the 3 readings as scheduled then multiply the absorbance by the factor which we will calculate in the calculation section. (if you don’t make the analyzer start reading after adding the sample immediately, you will get false low result) DON’T forget to flush again at the end of the test if it has a suction system. IT IS EASIER THAN SPECTROPHOTOMETER



الخطوات:- بنحضر الكيتس ذي ما قولنا وننضف الكيوفت والانابيب او نخلي الجهاز النصف اوتوماتك يشطف الأماكن اللى هتنزل فيها الreagent  والعينة وبنصفر الجهاز بماية مقطرة او على الهوا عند 340 وبنسحب بالماصة 1 مللي من الكيتس اللى حضرناها وبنحطها في انابيب وبنحضن لمدة دقيقة عند درجة حرارة25 او 37 او عند 30 وطبعا فترة التحضين عشان الكيتس ياخد درجة حرارة25 او 37 او 30 على حسب درجة الحرارة اللى بتشتغل عليها … بعد كدة هناخد 100 ميكرو من العينة وتحطهم على ال1مللي من الكيتس اللى سايبه يتحضن وبتعمل ميكس كويس وبتحضن الخليط لمدة دقيقة عند درجة الحرارة اللى بدات عليها … بعد كدة بتشغل التايمر وبعد دقيقة بتقيس الabsorbance وبترجع المحلول للحمام المائي وبعد كدة تعدي دقيقة كمان وتاخد قراءة تاني وترجع الخليط للتحضين وبعد دقيقة كمان تاخد قراءة تالتة … وبعد كدة بتقيس متوسط الامتصاص خلال الدقيقة الواحدة يعنى انت اخدت اول قراءة بعد او دقيقة تبقى هي دى الامتصاص لكل دقيقة بس انت اخدت 3 قراءات فهنجيب المتوسط بتاعهم يعنى هنجمهم ونقسم على 3 وهنا بيقولك ولو كانت العينة هيموليزد او يعنى فيها هيموجلوبين نتيجة تكسير كرات الدم الحمرا اثناء سحب العينة هتغير العينة وهتجيب عينة تانية ولو كانت فيها دهون يعنى السيرم  مشبر او العينة فيها بليروبين كتير يبقى هتخفف السيرم او البلازما بماية مقطرة تخفيف 1 ل10 يعنى مثلا 50 ميكرو سيرم تحط عليها 450 ميكرو ماية مقطرة. اضغط هنا عشان تعرف اذاي بنعمل تخفيف واذا تحسب معامل التخفيف.

وطبعا لو انت بتستخدم جهاز نصف اوتوماتك، بعد ما تشطف نظام الشفط او هتنضف الكيوفتات هتختار البرنامج بتاع تحليل ALT اللى انت برمجته أساسا بناءا على الكيتس اللى بتشتغل بيها لما جبت الجهاز جديد او لما غيرت الكيتس … بعد كدة لو الجهاز بتاعك سيمي اوتوميتيد ومن غير نظام شفط او suction يعنى يبقى هتحط الreagent في الكيوفيت علطول ولو ليه نظام شفط هتحطه في انابيب وسواء كيوفيت او انابيب هتحطها في مكان التحضين في الجهاز او في الحمام المائي ولما تسيبها في التحضين فترة بتحط العينة بتاعتك سواء سيرم او بلازما وبعد كدة بتبدا قراءة علطول … طبعا البرنامج بتاع الجهاز بيعد مع نفسه ال3 دقايق وفي كل دقيقة بياخد قراءة وبيحسب وبيضرب في الفاكتور اللى بتشوفه في البانفلت بتاعة الكيتس واللى هنشوف فالعنوان بتاع الcalculation اذاي بيتحسب … لو اتاخرت شوية فانك تخلي الجهاز يبدا قراءة التحليل ويحسب الوقت هتكون النتيجة غلط لانها هتكون اقل من المفروض تكون عليه ومتنساش تشطف نظام الشفط تاني بعد نهاية التحليل … طبعا ده اسهل بكتير.

Question

In this procedure, we didn’t measure the standard although you tell us that there is a standard???

Answer:

Because in this procedure we didn’t measure the concentration of ALT but its activity where we measure the rate of increment of pyruvate but the standard in this case is used as control to detect the validity of the reagents.

في الخطوات مقسناش الستاندرد بالرغم انك قولت ان فيه ستاندرد؟ ليه ؟؟؟ عشان في الخطوات دى احنا مشبنقيش تركيز انزيم الALT ولكن بنقيس نشاطه فاحنا بنقيس معدل الزيادة في تركيز البيروفيت ولكن الstandard هنا بيستخدم ككنترول عشان نختبر بيه صلاحية الreagent يعنى نعرف هو باظ ولا لا

5) Calculation:-

After you get the 3 absorbance values, you will take the average of the ΔA in the 3 readings:-

CMBX12

The ALT activity is calculated in the sample from the next equation:-

CMBX12

Read the calculation of ALT in the basics of Kinetic techniquesclick here to know how we get this equation and how to find out the measuring units.

(ε) is the molar absorptivity of NADH at 340nm; equals 6300 (i.e. measuring the amount of light absorbed per mole when the light pass through a path length of 1 cm)

(l) is the cuvette path length; 1 cm

(Vt) the total volume of the reaction; 1.1ml (1.0 reagent +0.10 sample) at 30oC or 1.05ml (1.0 reagent + 0.05 sample) at 37oC

(Vs) the sample volume; 0.1 at 30oC or 0.5ml at 37oC

(106) 1000 to convert U/ml to U/L and 1000 for conversion from Millimolar absorptivity of NADH to molar absorptivity; the unit of the molar absorptivity.

Spinreact calculate the factor, at 30oC

alt biosystems

But in spinreact kit the factor is 1750 not 1746

Then it gives factors to convert from temp to another;

  • To correct results to other temperatures multiply by:
Assay

temperature

Conversion factor to
25ºC30ºC37ºC
25ºC

30ºC

37ºC

1,00

0,76

0,55

1,32

1,00

0,72

1,82

1,39

1,00

How to use this table? If you perform the test at 250C and want to convert the value of the result to the value at 30OC, then you should to multiply the result by 1.32

If the sample is lipemic and you dilute the sample 1 in 10, for example, at 30oC, you will add 0.9ml (900µl) distilled water to 0.1ml (100 µl) sample (1:10) then the sample volume after dilution will be 1 ml and during the test you will take 0.1 ml of this diluted sample. The dilution is factor calculated form the following equation:-

dilution-factor

If you want to know how to calculate the dilution factor. Click here

You can multiply this dilution factor by that of the kits if you dilute the sample before the test (1746 x 10)

نيجي للحسابات عشان نبقى فاهمينها …. الabsorbance بتاع كل قراءة انت بتاخدها بتبقى عبارة عن الامتصاص بتاع العينة مطروح منه الامتصاص بتاع البلانك ولكن احنا القراءة اللى بنطلعنا بناخدها علطول على انها بتاعة العينة لأننا خلينا الجهاز يقرا الامتصاص بتاع البلانك بصفر وهنا طبعا قيمة الabsorbance بتبقى لكل دقيقة فهنكتبها ΔA/min وهنجيب متوسط ال3 قراءات يعنى هنجمع ال3 قيم ونقسم على 3 وبعد كدة هنجيب قيمة الactivity بتاعة الALT من المعادلة

CMBX12

طبعا كلنا عارفين الرموز الموجودة في المعادلة … ال (ε)اسمها الmolar absorptivity  ومن اسمها دى بتعبر عن كمية الضوء الممتص بواسطة المول الواحد من المادة عندما يكون مسار الضوء في الكيوفيت 1سم دى هي اللى ممكن نوضحا بالعربي ولكل مادة ليها molar absorptivity ثابتة عن طول موجي معين وبالنسبة للNADH هنا 6300 عند 340 نانو.

لما نحسب القيم المعلومة عشان نطلع الفاكتور اللى هنضرب فيه بيكون 1746 ولكن في الكيتس بتاع spinreact الفاكتور فيه 1750 وبعد كدة الكيتس ده مقدم جدول فيه فاكتور تاني للتحويل من درجة حرارة للتانية … في الجدول ده لو انت مثلا شغال التحليل عند درجة حرارة 25 وعايز تطلع النتيجة كانك شغالها عند 30 يبقى هتضرب في 1.32 وبرضو نفس الكلام لو العينة فيها دهون كتير يبقى هتخفف العينة 1ل10 يعنى هتاخد 900 ميكرو ماية مقطرة على 100 ميكرو من السيرم وبعد كدة هتحسب التخفيف بNxV=NxV هتلاقيها برضو انك هتضرب في 10. لو عايز تعرف بنخفف وبنحسب معامل التخفيف اذاي اضغط هنا.

6) Reference range:-

 25oC30oC37oC
Men (up to)22 U/L29 U/L40 U/L
Women (up to)18 U/L22 U/L22 U/L

Normal newborns have been reported to show a reference range of up to double the adult, attributed to the neonate’s hepatocytes. These values decline to adult levels by approximately 3 months of age.

These values are for orientation purpose; each laboratory should establish its own reference range.

هنا مدينا القيم الطبيعية عند كل درجة حرارة وبيقول ان في حديثي الولادة بتكون القيم الطبيعية ضعف البالغين وبترجع القيم طبيعية تاني بعد 3 اشهر

IV) Sources of errors:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

V) Quality Control:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

VI) Interpretation of test results:-

اقراها في تحليل الALT الفكرة العامة . اضغط هنا

References:-

clevelandcliniclabs.com

labtestonline.com

spinreact.com

boisystems.es

Sankara Nethralaya’s Manual of Medical Laboratory Techniques

Wallach’s Interpretation of Diagnostic Tests Pathways to Arriving at a Clinical Diagnosis

Comments

Facebook Comments

Leave a Reply