فكرة عمل الطريقة الكاينتك لتحليل الانزيمات

Principle of Kinetic technique for enzyme testing

فكرة عمل الطريقة الكاينتك لتحليل الانزيمات

Basics of kinetic technique:-

The main goal of the enzymatic assay is to measure the activity of the enzyme not the concentration because the enzymatic reaction is affected by many factors. In this test, the substrates are applied for the enzyme under testing and measure the amount of substrate disappeared or decreased per time intervals or measure the amount of products appeared or increased per time intervals.

Enzymatic reaction depends on some factors; such as:-

  • Temperature:- The higher temperature increases the kinetic energy of the substrates and enzyme molecules, leading to increasing the chance for colliding between them and thus increase the rate of the reaction. And the low temperature does opposite action.
  • pH:- Hydrogen ions (H+) and hydroxide ions (OH) change the allosteric site of the enzyme (i.e. the site used to catalyze the reaction) leading to inhibition of the enzyme activity. Each enzyme has a specific Optimum PH at which its activity is optimum.
  • The Concentration of the enzyme or substrate concentration:- increasing the enzyme concentration (while the substrate concentration is stable) increases the rate of the reaction. Also, increasing the concentration of the substrate (while the enzyme conc. is stable) will increase the rate of the reaction.

From these factors, you can conclude that if the enzyme concentration is high and the substrate concentration is constant, the reaction will be finished quickly and if it was low, the reaction finished slowly. And if the enzyme concentration is high and the temperature and/or pH is not suitable for enzyme activity, the reaction will be slow or will not occur. So, this is what meant by the activity of an enzyme. Therefore, we measure the activity of the enzyme not its concentration because the enzyme may be there but inactive.

So, to detect the real increment of the enzyme concentration or activity, we should make other factors constant because if they are not constants, the activity is changed and you will get the wrong results of your tests. This means that:-

  • The test should be performed at a constant temperature at the optimal temperature of the enzyme.
  • The test should be performed at a constant pH at the optimal pH value of the enzyme.
  • The concentration of the substrate provided by the reagent should be constant because if the enzyme concentration is high, its activity will be high and hence the reaction will be ended quickly and vice versa.

But how we measure the activity of an enzyme?? This can be done by 2 ways:-

  • Measuring the rate of the substrate disappeared or decreased from the reaction per time intervals. Or
  • Measuring the rate of products appeared or increased in the reaction per time intervals.

Way 2 is the more accurate. WHY? Because measuring or detecting small changes in products, when its concentration is zero, is easier to measure than detecting small changes when the substrate concentration is decreased.

Note that the kinetic method depends on the absorption at a wavelength in the UV region.

هنتكلم هنا عن الفكرة العامة لطريقة التحليل الكاينتك …. الهدف الرئيسي من تحليل الانزيمات بيكون انك تقيس نشاط الانزيم مشتركيزه عشان مهما كان تركيزه فهو بيتاثر بعوامل تانية هنشوفها دلوقتى … بنعمل ايه في طريقة التحليل دى؟ الانزيم لازم يشتغل على الsubstrate اللى هو المواد اللى هيحفز تفاعلها مع بعض .. يبقى اول حاجة في التحليل اننا هنديله المواد اللى بيشتغل عليها وبعد كدة بنقيس معدل اختفاء المواد المتفاعلة دى مع مرور الوقت او هنقيس ظهور او زيادة تركيز النواتج مع مرور الوقت.

بالنسبة للعوامل اللى بتاثر على نشاط الانزيم:-

درجة الحرارة:- لما درجة الحرارة تزيد الطاقة الحركية لجزيئات المتفاعلات وكمان جزيئات الانزيم هتزيد يعنى حركة الجزئيائت او اهتزازها في مكانها هنزيد وبالتالي هتزيد فرصة تصادم الجيزئات مع بعضها وبالتالي سرعة او معدل التفاعل هتزيد وطبعا درجة الحرارة القليلة بتعمل العكس.

الpH :- طبعا ايونات الهيدروجين او ايونات الهيدروكسيل بتغير شكل ال الوستيرك سايت allosteric site او الموقع اللى على الانزيم اللى بيحصل عليه التفاعل أساسا وبالتالي طالما اتغير شكل الموقع ده يبقى الانزيم مشهيحفز التفاعل وبالتالي مفيش تفاعل حتى لو تركيز الانزيم عالي وكل انزيم بيشتغل في تركيز معين من ايونات الهيدروجين او الهيدروكسين

تركيز الانزيم او تركيز المتفاعلات:- زيادة تركيز الانزيم مع ثبات تركيز المتفاعلات بيزود معدل التفاعل والعكس لو التركيز قليل وبرضو زيادة تركيز المتفاعلات بيزود معدل التفاعل برضو.



من كل العوامل اللى بنتكلم فيها دى …. ممكن نستنتج ان لو تركيز الانزيم عالي وتركيز المتفاعلات ثابت، التفاعل هينتهي بسرعة ولو تركيز الانزيم زيادة هنيتهى ببطئ ولو كان تركيز الانزيم عالي ودرجة الحرارة والpH مشمناسبين لشغله يبقى التفاعل اما هيمشى ببطئ او مشهيبدأ اساساً وبالتالي احنا يهمنا نشاط الانزيم لانه ممكن يكون موجود ومش شغال.

بالتالي عشان تكتشف ان الانزيم تركيزه عالي ولا لا؟ لازم تثبت باقي العوامل عشان لو باقي العوامل مثبتتش يبقى نشاطه هيتغير ذي ما قولنا وبالتالي نتيجة التحليل هتكون غلط تماما .. وده معناه انك لازم تعمل التحليل عند درجة حرارة ثابتة واللى هي درجة الحرارة المناسبة لعمل الانزيم واكيد هتكون 37 درجة وبرضو لازم تبقى الpH ثابتة عند الpH المناسبة لعمل الانزيم ولازم تركيز المتفاعلات يكون ثابت عشان لو تركيز الانزيم عالي يبقى النشاط بتاعه عالي والتفاعل هيخلص بسرعة ولو قليل هيحصل العكس.

طيب اذاي هنقيس نشاط الانزيم…. ده بيحصل بطرقتين الأولى:- قياس معدل النقص في تركيز المتفاعلات بمرور الزمن والتانية:- قياس معدل الزيادة في تركيز النواتج مع مرور الزمن. والطريقة التانية احسن عشان الكشف عن ظهور او زيادة تركيز كميات قليلة من النواتج لما التركيز يكون صفر بيكون اسهل من قياس نقصان كميات قليلة من المتفاعلات.

كمان الطريقة الكاينتك بتعتمد على امتصاص الضوء في منطقة الUV

How to measure or calculate it practically?

We know that we measure the activity of an enzyme, not a concentration. Also, we know that we measure the activity of an enzyme by measuring the rate of the product appeared or increased  from the reaction per time intervals. This means that there is not any standard solution for the activity of an enzyme. So, we can’t calculate the enzyme activity by the same equation used to calculate the analyte concentration in the colorimetric technique click here.

a

We will measure the absorbance of products per time intervals. To measure the absorbance per time intervals, you should measure the absorbance more than once per time intervals. Usually, 3 readings of absorbance are measured through 3 mins; one reading every one minute. In each reading, we take ΔA (absorbance difference). Let’s take Alanine Aminotransferase test (ALT test) as an example.

In each reading, the ΔA/min = (Asample/min) – (Ablank/min) but the absorbance value we get from the instrument is for the sample because we make the instrument to read the absorbance of the blank zero. So, ΔA/min = Asample – 0 = Asample

After you get the 3 absorabnce values, you will take the average of the ΔA in the 3 readings:-

CMBX12

The ALT activity is calculated in the sample from the next equation:-

CMBX12

(ε) is the molar absorptivity of NADH at 340nm; equals 6300 (i.e. measuring the amount of light absorbed per mole when the light pass through a path length of 1 cm)

(l) is the cuvette path length; 1 cm

(Vt) the total volume of the reaction; 1.1ml (1.0 reagent +0.10 sample) at 30oC or 1.05ml (1.0 reagent + 0.05 sample) at 37oC

(Vs) the sample volume; 0.1 at 30oC or 0.05ml at 37oC

(106) 1000 to convert from mol to μl.

Could you prove this equation?

The proof is very simple. Do you remember Beer-lamert law? Which is

Absorbance = ε b C

Where (ε) is the molar absorptivity, (b) is the cuvette path length; 1 cm and (C) is the concentration the analyte of activity of the enzyme

Let’s replace (C) with ALT activity and (b) with(l). So,

proof 1

Now, we should take into account the dilution factor. Do we dilute the sample? The answer is yes we do. Explain how? When you add the reagent to the sample you actually dilute it and you should consider this in your equation. Think what is the difference between dilution with distilled water and your reagent???!!! Of course nothing. BUT HOW CAN WE CALCULATE IT? Click here to see how to make dilutions and calculate the dilution factor.

The dilution factor will be the total volume (Vt) divided by the volume of the sample (Vs). Then the equation will be:-

proof 2

In the equation above, we see that there is 106­­ in the numenator. WHY? To know why, you should conclude the unit of measuring the ALT activity. The unit is one international unit per liter U/L.

The units of measuring ALT activity is one international unit (U) per liter. U is the amount of enzyme that transforms 1 µmol of substrate per minute, in standard conditions. Let’s see the unit conversions in the following equation to understand this.

Let’s see the units of each item in the equation:-

  • (No units) for absorbance.
  • (ml) fro Volume of the sample or the total volume is measured by ml.
  • (cm) for (l)
  • (liter mol-1 cm-1) for (ε)

So,

proof-3

So, we should multiply the final equation by 106

Where μmol/min equals one international unit (U), then the measuring unit will be U/L.

طيب اذاي احسب نشاط الانزيم عمليا في المعمل؟؟ بسيطة ياسيدي …احنا عرفنا ان الانزيم بيتقاس بالنشاط بتاعه مشبالتركيز وعرفنا كمان انك عشان تقيس نشاط انزيم هتقيس معدل ظهور النواتج مع مرور الوقت … ده معناه انك مشهتكون محتاج محلول قياسي عشان تقيس نشاط الانزيم وبالتالي مشهتقدر تحسب نشاط الانزيم بنفس المعادلة اللى بنستخدمها في حساب تركيز اي مادة بالطريقة الكوليمترك اضغط هنا

عشان تقيس النشاط عن طريق ظهور النواتج يبقى هتقيس امتصاص النواتج بعد مرور  وقت معين … عشان تعمل ده عادة بنفيس 3 قراءات على مدار 3 دقايق يعني كل دقيقة ناخد قراءة … بس في كل قراءة احنا مشبناخد absorbance لوحده كدة لكن احنا بناخد فرق في الامتصاص … تعالي ناخد تحليل انزيم ALT كمثال

نيجي للحسابات عشان نبقى فاهمينها …. الabsorbance بتاع كل قراءة انت بتاخدها بتبقى عبارة عن الامتصاص بتاع العينة مطروح منه الامتصاص بتاع البلانك ولكن احنا القراءة اللى بنطلعها بناخدها علطول على انها بتاعة العينة لأننا خلينا الجهاز يقرا الامتصاص بتاع البلانك بصفر وهنا طبعا قيمة الabsorbance بتبقى لكل دقيقة فهنكتبها ΔA/min وهنجيب متوسط ال3 قراءات يعنى هنجمع ال3 قيم ونقسم على 3 وبعد كدة هنجيب قيمة الactivity بتاعة الALT من المعادلة

طبعا كلنا عارفين الرموز الموجودة في المعادلة … ال (ε)اسمها الmolar absorptivity  ومن اسمها دى بتعبر عن كمية الضوء الممتص بواسطة المول الواحد من المادة عندما يكون مسار الضوء في الكيوفيت 1سم دى هي اللى ممكن نوضحا بالعربي ولكل مادة molar absorptivity ثابتة عند طول موجي معين.

طيب هل تقدر تثبتلنا المعادلة دي حسابيا؟ … نقدر طبعا … فاكرين قانون beer-lamert law اللى بيقول ان A=εbc … والb هي نفسها ال (l) اللى في المعادلة واللى هي طول ضلع الكيوفيت اللى هيمشي فيه الضوء… والC عبارة عن تركيز المادة اللى بنقيس الامتصاص بتاعها او نشاط الانزيم لو بتعمل تحليل لاي انزيم… لما نخلي الc في طرف والباقي في طرف تاني في المعادلة هنلاقي المعادلة بقت بالشكل الاتي:-

proof 1

فاضل بقى نعمل حساب معامل التخفيف .. هتسالني مثلا تقولى وهو احنا أساسا خففنا العينة … هقولك اه طبعا … انت مشضفت حجم معين من الreagent .. هيفرق ايه عن إضافة الماية المقطرة وانت بتخفف …. ال2 واحد … طيب هتحسبه اذاي؟؟ اضغط هنا عشان تعرف اذاي بنعمل تخفيف واذا تحسب معامل التخفيف. المهم ان معامل التخفيف هيكون عبارة عن قسمة الحجم الكلي للمحلول على حجم العينة … والمعادلة هتكون بالشكل التالي:-

proof 2

هتقولي دلوقتى فيه 106 في البسط … محطهاش ليه … عشان تعرف دي جات منين يبقى لازم تستنتج وحدة القياس بتاعة انزيم الALT … دلوقتى وحدة القياس عبارة عن وحدة قياس دولية لكل لتر …اذاي تستنتجها بقى؟؟؟؟ ووحدة القياس الدولية دي عبارة عن كمية الانزيم اللى تقدر تحول او تنشط تفاعل 1µmol من المادة في الدقيقة الواحدة …. وعشان تعرف هتيجي اذاي لازم الأول تعرف وحدات القياس بتاعة كل حاجة موجودة في المعادلة … الامتصاص ملوش وحدة قياس والحجم سواء الكلي او بتاع العينة هيتقاس بالml والl اللى هي طول ضلع الكيوفيت هتتقاس بالcm اما بقى بالنسبة لε فهتتقاس ب liter mol-1 cm-1 تعالي بقى نشيل كل حاجة ونحط وحدة القياس بتاعها ….

proof-3

وكدة عرفنا ليه بنضرب في 106 وعرفنا كمان ليه اختار U/L كوحدة قياس.

Examples:-

ALT test (Alanine Aminotransferase)

AST test (Aspartate Aminotransferase)

Comments

Facebook Comments