تحليل الالانين امينوترانسفيريز (ALT) او الGPT|كاينتك IFCC|Biosystems

تحليل انزيم الALT في الدم

من دلائل وظائف الكلية

Kinetic Technique (IFCC Method)

By BIOSYSTEMS kits

I) Introduction

1) Names:-

Formal name: Alanine Aminotransferase and abbreviated as (ALT)

Also known as: Serum Glutamic-Pyruvic Transaminase; SGPT; GPT; Alanine Transaminase.

2) What is the ALT?

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Why it is required?

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

4) When should you get tested?

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

5) What are the needed preparations before the test?

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

II) Required sample:-

1) Sample type:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

2) Sample collection method:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Criteria for sample rejection:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

III) The Test:-

Kinetic technique (IFCC METHOD)

By BIOSYSTEMS kits

1) Principle

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

2) Devices used:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

3) Reagents:-

  • Composition:-
    • Reagent 1 (R1) (Substrate and BUFFER 7.3): Tris 150 mmol/L, L-alanine 750 mmol/L, lactate dehydrogenase > 1350 U/L, pH 7.3.
    • Reagent 2 (R2) (substrate): NADH 1.9 mmol/L, 2-oxoglutarate 75 mmol/L, Sodium hydroxide 148 mmol/L, sodium azide 9.5 g/L.
  • STORAGE
    • Store at 2-8ºC.
    • Reagents are stable until the expiry date shown on the label when stored tightly closed and if contaminations are prevented during their use.
  • Indications of deterioration:
    • Presence of particulate material, turbidity, absorbance of the blank lower than 1.400 at 340 nm (1 cm cuvette).
  • Reagent preparation
    • Working Reagent: Pour the contents of the R2 into R1 bottle. Mix gently.
      • Other volumes can be prepared in the proportion: Mix 4 vol or R1 + 1 Vol of R2. Mix gently. (because the cuvette is filled by 1 ml, you will mix 800µl R1 with 200µl R2 [4R1:1R2]).
      • Stable for 1 month at 2-8ºC.

بالنسبة للكيتس بتاعة بويسيستمز biosystms بتتكون من حاجتين R1 وده فيه واحد من المتفاعلات وهو ال الانين وكمان الbuffer عشان يظبط الpH  ومعاهم الLDH المطلوب في المعادلة التانية وR2 وده بيتكون من الاوكسوجلوتاريت اللى هو المتفاعل التاني كمان معاه الNADH اللى هيتاكسد بتفاعله مع البيروفيت عشان نقيس نشاط الALT

الكيتس بيتخزن عند درجة حرارة من 2 ل8 يعنى في التلاجة والكيتس بتبقى ثابتة لحد تاريخ انتهاء الصلاحية طالما مقفولة كويس وطبعا لو حفظتها برضو من التلوث وتعرف ان الكيتس بقى مينفعش تشتغل بيه لما تلاقي تعكير او درجة الامتصاص بتاعه كبلانك عند 340 اقل من 1.400

بنحضر الكيتس كالاتي:- بنصب R2 في R1 ونخلط كويس او لو مشعايز تعمل كدة في الكمية كلها بتحط مثلا بنسبة 4R1:1R2 يعنى مثلا 4 مللي من R1 على 1 مللي من R2 .. والخليط ده بيفضل صالح لمدة شهر في التلاجة عند درجة حرارة 2 ل 8.


4) Procedure:-

Note:- these procedures are for spectrophotometer users, not for semi-automated users

  1. Prepare the work solution as mentioned in the reagent in test tube.
  2. Clean the cuvettes if you use a spectrophotometer or semi-automated analyzer without suction system or flush the aspiration system of your semi-automated analyzer if it is with suction system by keeping the tubing in a distilled water for 2 minutes.
  3. Zero spectrophotometer or photometer with distilled water or air at 340nm.
  4. Pipette 1.0ml of the prepared working reagent into appropriate tubes or cuvettes and incubate at 37oC or 30oC for five minutes in the water bath or in the spectrophotometer if it has built-in incubator (this incubation to bring the reagent to 37oC or 30oC).
  5. Transfer and mix well 0.10ml (100µl) of the sample if the incubation temperature of the reagent is 30oC and 0.05ml (50µl) of sample if it is 37oC to the incubated 1.0 ml working solution.
  6. Start the stopwatch immediately after sample addition and wait for one mintue delay. This delay to make the reaction happen and all the pyruvate is produced (NOTE:- the volume of the sample and the incubation time is recommended by the reagent supplier).
  7. After the one-minute delay, read and record absorbance after 1 minute at 340nm.
  8. Return tube to incubation.
  9. Repeat readings every minute for the next two minutes.
  10. Calculate mean absorbance difference/minute (ΔA/Min.).
  11. If the sample is hemolyzed, collect another sample and if it is icteric or lipemic, dilute the sample 1 in 10 with distilled water (read in how to make dilution and calculate the dilution factor. click here).

In the case, if you use a semi-automated analyzer, you will flush the suction system if it has a suction system or clean the cuvettes if it has not a suction system. Then choose the programmed procedure for ALT test (you program it according to the reagent supplier). In this case, you can prepare the working solution in a cuvette if it has not a suction system or tube if it has a suction system. Then place the cuvettes or tubes in the thermostable cell holder of the semi-automated analyzer or in the water bath, then read the blank and then add the sample, start reading immediately after adding the sample, where the analyzer starts its own timer and takes the 3 readings as scheduled then multiply the absorbance by the factor which we will calculate in the calculation section. (if you don’t make the analyzer start reading after adding the sample immediately, you will get false low result) DON’T forget to flush again at the end of the test if it has a suction system. IT IS EASIER THAN SPECTROPHOTOMETER



الخطوات:- بنحضر الكيتس ذي ما قولنا ونضف الكيوفت والانابيب او نخلي الجهاز النصف اوتوماتك يشطف الأماكن اللى هتنزل فيها الreagent  والعينة وبنسحب بالماصة 1 مللي من الكيتس اللى حضرناها وبنحطها في انابيب وبنحضن لمدة 5 دقايق عند درجة حرارة 37 او عند 30 وطبعا فترة التحضين عشان الكيتس ياخد درجة حرارة 37 او 30 على حسب درجة الحرارة اللى بتشتغل عليها … بعد كدة لو بتشتغل عند 30 هناخد 100 ميكرو من العينة ولو بتشتغل عند 37 هتاخد 50 ميكرو وتحطهم على ال1مللي من الكيتس اللى سايبه يتحضن وبتعمل ميكس كويس وبتحضن الخليط لمدة دقيقة عند درجة الحرارة اللى بدات عليها وتشغل التايمر بمجرد وضع العينة … بعد كدة بتقيس الabsorbance بعد دقيقة وبترجع المحلول للحمام المائي وبعد كدة تعدي دقيقة كمان وتاخد قراءة تاني وترجع الخليط للتحضين وبعد دقيقة كمان تاخد قراءة تالتة … وبعد كدة بتقيس متوسط الامتصاص خلال الدقيقة الواحدة يعنى انت اخدت اول قراءة بعد اول دقيقة تبقى هي دى الامتصاص لكل دقيقة بس انت اخدت 3 قراءات فهنجيب المتوسط بتاعهم يعنى هنجمعهم ونقسم على 3. ولو كانت العينة هيموليزد او يعنى فيها هيموجلوبين نتيجة تكسير كرات الدم الحمرا اثناء سحب العينة هتغير العينة وهتجيب عينة تانية ولو كانت فيها دهون يعنى السيرم  مشبر او العينة فيها بليروبين كتير يبقى هتخفف السيرم او البلازما بماية مقطرة تخفيف 1 ل10 يعنى مثلا 50 ميكرو سيرم تحط عليها 450 ميكرو ماية مقطرة. اضغط هنا عشان تعرف اذاي بنعمل تخفيف واذا تحسب معامل التخفيف.

وطبعا لو انت بتستخدم جهاز نصف اوتوماتك، بعد ما تشطف نظام الشفط او هتنضف الكيوفتات هتختار البرنامج بتاع تحليل ALT اللى انت برمجته أساسا بناءا على الكيتس اللى بتشتغل بيها لما جبت الجهاز جديد او لما غيرت الكيتس … بعد كدة لو الجهاز بتاعك سيمي اوتوميتيد ومن غير نظام شفط او suction يعنى يبقى هتحط الreagent في الكيوفيت علطول ولو ليه نظام شفط هتحطه في انابيب وسواء كيوفيت او انابيب هتحطها في مكان التحضين في الجهاز او في الحمام المائي ولما تسيبها في التحضين فترة بتحط العينة بتاعتك سواء سيرم او بلازما وبعد كدة بتبدا قراءة علطول … طبعا البرنامج بتاع الجهاز بيعد مع نفسه ال3 دقايق وفي كل دقيقة بياخد قراءة وبيحسب وبيضرب في الفاكتور اللى بتشوفه في البانفلت بتاعة الكيتس واللى هنشوف فالعنوان بتاع الcalculation اذاي بيتحسب … لو اتاخرت شوية فانك تخلي الجهاز يبدا قراءة التحليل ويحسب الوقت هتكون النتيجة غلط لانها هتكون اقل من المفروض تكون عليه ومتنساش تشطف نظام الشفط تاني بعد نهاية التحليل … طبعا ده اسهل بكتير.

Question

In this procedure, we didn’t measure the standard although you tell us that there is a standard???

Answer:

Because in this procedure we didn’t measure the concentration of ALT but its activity where we measure the rate of increment of pyruvate but the standard in this case is used as control to detect the validity of the reagents.

في الخطوات مقسناش الستاندرد بالرغم انك قولت ان فيه ستاندرد؟ ليه ؟؟؟ عشان في الخطوات دى احنا مشبنقيش تركيز انزيم الALT ولكن بنقيس نشاطه فاحنا بنقيس معدل الزيادة في تركيز البيروفيت ولكن الstandard هنا بيستخدم ككنترول عشان نختبر بيه صلاحية الreagent  يعنى نعرف هو باظ ولا لا

5) Calculation:-

After you get the 3 absorbance values, you will take the average of the ΔA in the 3 readings:-

CMBX12

The ALT activity is calculated in the sample from the next equation:-

CMBX12

Read the calculation of ALT in the basics of Kinetic techniquesclick here to know how we get this equation and how to find out the measuring units.

(ε) is the molar absorptivity of NADH at 340nm; equals 6300 (i.e. measuring the amount of light absorbed per mole when the light pass through a path length of 1 cm)

(l) is the cuvette path length; 1 cm

(Vt) the total volume of the reaction; 1.1ml (1.0 reagent +0.10 sample) at 30oC or 1.05ml (1.0 reagent + 0.05 sample) at 37oC

(Vs) the sample volume; 0.1 at 30oC or 0.5ml at 37oC

(106) 1000 to convert U/ml to U/L and 1000 for conversion from Millimolar absorptivity of NADH to molar absorptivity; the unit of the molar absorptivity.

Now, at 30oCalt biosystems

Now, at 37oC

alt biosystems 37

If the sample is lipemic and you dilute the sample 1 in 10, for example, at 30oC, you will add 0.9ml (900µl) distilled water to 0.1ml (100 µl) sample (1:10) then the sample volume after dilution will be 1ml and during the test you will take 0.1 ml of this diluted sample. The dilution is factor calculated form the following equation:-

dilution-factor

If you want to know how to calculate the dilution factor. Click here

You can multiply this dilution factor by that of the kits if you dilute the sample before the test (1746 x 10)
And at 37oC, you will dilute the serum as follow:- 450µl distilled water will be added to 50µl serum

نيجي للحسابات عشان نبقى فاهمينها …. الabsorbance بتاع كل قراءة انت بتاخدها بتبقى عبارة عن الامتصاص بتاع العينة مطروح منه الامتصاص بتاع البلانك ولكن احنا القراءة اللى بنطلعنا بناخدها علطول على انها بتاعة العينة لأننا خلينا الجهاز يقرا الامتصاص بتاع البلانك بصفر وهنا طبعا قيمة الabsorbance بتبقى لكل دقيقة فهنكتبها ΔA/min وهنجيب متوسط ال3 قراءات يعنى هنجمع ال3 قيم ونقسم على 3 وبعد كدة هنجيب قيمة الactivity بتاعة الALT من المعادلة

CMBX12

طبعا كلنا عارفين الرموز الموجودة في المعادلة … ال (ε)اسمها الmolar absorptivity  ومن اسمها دى بتعبر عن كمية الضوء الممتص بواسطة المول الواحد من المادة عندما يكون مسار الضوء في الكيوفيت 1سم دى هي اللى ممكن نوضحها بالعربي ولكل مادة ليها molar absorptivity ثابتة عند طول موجي معين وبالنسبة للNADH هنا 6300 عند 340 نانو

طبعا هنا احنا قايلين اننا بناخد 100 ميكرو سيرم عند درجة حرارة 30 و50 ميكرو عند 37 بالتالي الحسابات هتختلف في الحالتين ذى ماشيفين في المعادلتين والفاكتور اللى بنضرب فيه هو جاي من حساب القيم المعلومة

هنا بيقولك لو العينة فيها دهون كتير مترفضهاش طبعا لكن هتخفف العينة 1 ل10 يعنى عند درجة حرار 30 هنجيب ال100 ميكرو سيرم وهتحط عليهم 900 ميكرو ماية مقطرة وبعد كدة هتحسب الdilution  فاكتور هو 10 بس لو عايز تعرف بتتحسب اذاي ممكن تقراها من هنا … وبرضو لو هتشتغل عند 37 درجة يبقى اذن هتضيف 450 ميكرو ماية مقطرة لل50 ميكرو سيرم

ولو انت مخفف ممكن تضرب الفاكتور بتاع الكيتس في 10 عادي لانك في النهاية هتضرب في ال10 برضو.

6) Reference range:-

  • At 30oC :- Up to 29 U/L
  • At 37oC :- Up to 41 U/L

Concentrations in newborns and infant are slightly higher than in adults. Values in men are slightly higher than in women.

هنا بقى المستوي الطبيعي للALT في الدم طبقا للكيتس وبيقول ان في حديثي الولادة والأطفال بتبقى اعلى من البالغين والقيم في الرجالة اعلى شوية من الستات.

IV) Sources of errors:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

V) Quality Control:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا 

VI) Interpretation of test results:-

اقراها في تحليل الALT  الفكرة العامة . اضغط هنا

References:-

  • clevelandcliniclabs.com
  • labtestonline.com
  • spinreact.com
  • boisystems.es
  • Sankara Nethralaya’s Manual of Medical Laboratory Techniques
  • Wallach’s Interpretation of Diagnostic Tests Pathways to Arriving at a Clinical Diagnosis
(0/5)0

Comments

Facebook Comments

Leave a Reply